Диагностика инфекционных заболеваний необходима для последующего проведения адекватной этиотропной терапии, направленной на уничтожение возбудителя патологического процесса. Выявление и идентификация патогенных микроорганизмов проводится при помощи различных методик лабораторной диагностики, одним из которых является бактериологическое исследование.
Бактериология как наука получила развитие в XIX веке благодаря внедрению бактериологических методик исследования.
Принцип и суть методики
Основной целью бактериологического исследования является выявление и последующая идентификация патогенного (болезнетворного) микроорганизма в исследуемом материале. Для этого проводится посев на специальные питательные среды (мясо-пептонный бульон, плотная среда агар), на котором при наличии возбудителя в материале через некоторое время вырастают колонии микроорганизмов. Их идентифицируют по микроскопическим (размер клеток, их форма, определенный цвет при окрашивании по Граму), биохимическим (способность расщеплять некоторые углеводы или 
белки) и антигенным (взаимодействие с антителами к основным классам возбудителя) свойствам. В целом на проведение данной методики диагностики требуется от 48 до 72 часов, что достаточно долго (особенно при необходимости быстрого начала этиотропной терапии инфекционной патологии). Тем не менее данный вид лабораторной диагностики не теряет своей актуальности на сегодняшний день, так как является достоверным для большого количества инфекционных заболеваний.
Очень часто во время бактериологического исследования дополнительно проводится определение чувствительности выделенного патогенного микроорганизма к основным группам современных антибиотиков. Это дает возможность в последующем подобрать наиболее эффективную этиотропную терапию.
Когда проводится бактериологическая диагностика
Показанием к проведению бактериального исследования служит диагностика различных инфекционных заболеваний, к которым относятся:
Также данная методика может проводится для определения возбудителя гнойных процессов различной локализации. В первую очередь это необходимо для определения чувствительности выявленных микроорганизмов к антибиотикам, так как при развитии гнойного процесса возбудители часто являются устойчивыми к большинству антибиотиков.
Диагностика дисбактериоза при помощи бактериологического исследования дает возможность определить вид условно-патогенных микроорганизмов, а также их количество, на основании чего делается заключение о выраженности нарушения нормальной микрофлоры.
Материалом при бактериологическом исследовании служит моча, кровь, мазки из полости носа, уретры, влагалища, прямой кишки, кал, сперма у мужчин, мокрота. Выбор материала зависит от показаний к проведению данного метода лабораторной диагностики и локализации патологического процесса.
Расшифровка результатов
В большинстве случаев результат исследования основывается на 2-х показателях - факт наличия выявляемого 
микроорганизма (положительный или отрицательный результат), а также количество бактериальных клеток на единицу объема исследуемого материала (данный показатель имеет место только при положительном результате). Численность бактерий выражается в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ). Чем выше данный показатель, тем большее количество бактерий в исследуемом материале. Также результат может включать показатели чувствительности выявленного микроорганизма к антибиотикам. Он обычно состоит из списка основных классов антибактериальных средств (
Культуральныйметод исследования представляет собой выделение из питательной средыбактерий определённого вида путём культивирования,с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.
Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой . После окончательной идентификации их характеристик, бактерии,выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.
Цель метода :
1. Этиологический диагноз, то есть выделение и идентификация чистой культуры бактерий.
2. Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.
3. Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей. Это необходимо для определения общности микроорганизмов выделенных в разных местах и разных условиях, что важно для эпидемиологических целей.
Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.
Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.
1 этап
А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение итранспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости отсвойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.
Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.
В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.
Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.
Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.
Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.
2 этап
А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности.Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.
Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре(для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).
Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:
· МПА
· 0,1% глюкозы
· 1% лактозы
· Специальный реактив на сероводород
· Феноловыйкрасный индикатор.
3 этап
А) Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.
Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.
Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).
В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.
Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.
Рис. Питательная среда Клиглера:
1 – исходная среда,
2 – рост E. coli,
3 – рост S. paratyphi B,
4 – рост S. Typhi.
E . coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.
S. paratyphi –
способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A-
не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B –
сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).
S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.
Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.
Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.
В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.
20. Характеристика бактериологического метода исследования
Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.
Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).
Этапы метода:
1. Забор материала для исследования.
2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.
3. Заключение.
Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).
Выделение чистой культуры . Включает 3 или 4 этапа:
1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.
2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.
3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой
целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают
морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).
4(5). Идентификация чистой культуры.
Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.
Оценка метода:
достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам;недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.
21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным средам, классификация.
Требования:
среды должны быть питательными
должны иметь определенные ph
должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.
должны быть влажными и не слишком жидкими
должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом
должны быть стерильными
должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.
Питательные среды можно разделить:
А) По происхождению:
1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);
2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;
Б) По назначению:
1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;
2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);
3) дифференциально-диагностические - позволяют отдифференцировать по внешнему виду среды один вид микроба от других (например среды Эндо, Левина для кишечной группы микробов).
Кроме того, в зависимости от целей использования в схеме выделения чистых культур, по назначению можно выделить следующие среды:
1) обогащения - подавляют рост микробов, сопутствующих возбудителю;
2) для получения изолированных колоний;
3) накопления чистой культуры;
В) По консистенции:
1) жидкие;
2) полужидкие (при добавлении агар-агара в концентрации 0,5-0,7%);
3) плотные - выше 1%.
Исследование бактерий имеет большое практическое значение для человека. На сегодняшний день открыто большое количество прокариот, которые отличаются друг от друга по патогенности, области распространения, форме, размерам, количеству жгутиков и другим параметрам. Чтобы детально изучить данный штамм, применяется бактериологический метод исследования.
Какие существуют методы клеток?
Чтобы определить, являются ли бактерии патогенными, проводят исследование культуры различными способами. Среди них:
1. Бактериоскопический метод.
2. Бактериологический метод.
3. Биологический метод.
Бактериоскопический и бактериологический основаны непосредственно на работе с клетками прокариот, когда биологический анализ требуется для изучения влияния таких клеток на живой организм подопытных животных. По степени проявления тех или иных признаков заболевания ученый может сделать вывод о наличии или отсутствии патогенных бактерий в пробе, а также естественно их размножить в организме животного для получения их культуры и использования в других работах.
Бактериологический метод исследования отличается от бактериоскопического. В первом для анализа используется специально подготовленная культура живых прокариот, когда во втором проводится работа с мертвыми или живыми клетками на предметном стекле.
Этапы бактериологического метода исследования. Микробиология
Принцип изучения свойств бактериальной культуры может пригодиться как для ученых-микробиологов, которые поставили цель исследовать прокариотические клетки, так и для лаборантов, задача которых заключается в установлении патогенности или непатогенности бактерий, а затем диагноза пациента.
Методика изучения бактерий делится на три этапа:
1. Выделение бактерий из первоначальной пробы.
2. Высевание бактерий и выращивание изучение ее свойств.
Первый этап
Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме.
Через двое-трое суток отбираются нужные колонии и высеваются на твердые среды чашек Петри с помочью стерильной петли. Во множестве лабораторий работают с пробирками, где может находиться твердая или жидкая питательная среда. Так и проводится бактериологический метод исследования в микробиологии.
Второй этап
После получения отдельных колоний бактерий проводится непосредственный макро- и микроанализ. Измеряются все параметры колоний, определяется цвет и форма каждой из них. Нередко проводится подсчет колоний на чашке Петри, а затем в исходном материале. Это имеет значение при анализе патогенных бактерий, от числа которых зависит степень заболевания.
Бактериологический метод исследования, 2 этап которого заключается в изучении отдельных колоний микроорганизмов, может быть сопряжен с биологическим способом анализа бактерий. Еще одна цель работы на этом этапе - увеличить количество исходного материала. Это можно сделать на питательной среде, а можно провести эксперимент в естественных условиях на живых подопытных организмах. Патогенные бактерии будут размножаться, и в результате кровь будет содержать миллионы клеток прокариот. Из взятой крови легко приготовить необходимый рабочий материал бактерий.
Третий этап
Самая важная часть исследования - это определение морфологических, биохимических, токсигенных и антигенных свойств культуры бактерий. Работа ведется с заранее «очищенными» культурами на питательной среде, а также с препаратами (зачастую окрашенными) под микроскопом.
Установить принадлежность патогенных или условно-патогенных бактерий к той или иной систематической группе, а также определить их устойчивость к лекарствам позволяет бактериологический метод исследования. 3 этап - антибиотики, т. е. анализ поведения клеток бактерий в условиях содержания лекарственных препаратов в окружающей среде.
Исследование устойчивости культуры к антибиотику имеет важное практическое значение, когда необходимо прописать для конкретного пациента необходимые, а главное, действенные препараты. Здесь и может помочь бактериологический метод исследования.
Что такое питательная среда?
Для развития и размножения бактерии должны находиться в заранее подготовленных питательных средах. По консистенции они могут быть жидкие или твердые, а по происхождению - растительные или животные.
Основные требования к питательным средам:
1. Стерильность.
2. Максимальная прозрачность.
3. Оптимальные показатели кислотности, активности воды и других биологических величин.
Получение изолированных колоний
1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.
2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток. Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой.
Этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.
Антибиотикограмма
Визуально реакцию бактерий на препараты можно заметить двумя практическими способами:
1. Метод бумажных дисков.
2. Разведение бактерий и антибиотика в жидкостной среде.
Метод бумажных дисков требует наличия культуры микроорганизмов, которые были выращены на твердой питательной среде. На такую среду кладут несколько бумажек округлой формы, пропитанных антибиотиками. Если препарат успешно справляется с нейтрализацией бактериальных клеток, после такой обработки останется участок, лишенный колоний. Если же реакция на антибиотик отрицательная, бактерии выживут.
В случае использования жидкой питательной среды сперва готовят несколько пробирок с культурой бактерий разных степеней разведения. В эти пробирки добавляют антибиотики, и в течение суток наблюдают за процессом взаимодействия вещества и микроорганизмов. В конечном итоге получается качественная антибиотикограмма, по которой можно судить об эффективности препарата для данной культуры.
Основные задачи анализа
Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.
1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.
2. на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.
3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.
4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам. При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков.
Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.
Особенности проведения анализа
Главное правило проведения бактериологического исследования - это максимальная стерильность. Если идет работа с пробирками, посевы и пересевы бактерий должны проводиться только над нагретой спиртовкой.
Все этапы бактериологического метода исследования требуют использования специальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть предварительно обработаны в пламени спиртовки. Что касается пастеровской пипетки, то тут перед термической стерилизацией необходимо отломать кончик пипетки пинцетом.
Техника посева бактерий тоже имеет свои особенности. Во-первых, при посеве на твердые среды проводят бактериальной петлей по поверхности агара. Петля, конечно же, уже должна иметь на поверхности образец микроорганизмов. Также практикуется посев внутрь и в этом случае петля или пипетка должны достичь дна чашки Петри.
При работе с жидкими средами используются пробирки. Здесь важно следить, чтобы жидкости не касались краев лабораторной посуды или пробки, а используемые инструменты (пипетка, петля) не дотрагивались до посторонних предметов и поверхностей.
Значение биологического метода исследования
Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.
Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.
Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.
9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
морфология и тинкториальные свойства
культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
серологические свойства (антигенные)
вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
патогенность для животных
фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
чувствительность к антибиотикам
другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 11. Схема изучения колоний
|
Возможные характеристики колоний |
||
|
Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
||
|
Величина, мм |
Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
|
|
Характер поверхности |
Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
|
|
Бесцветные, окрашенные |
||
|
Прозрачность |
Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
|
|
Характер краев |
Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
|
|
Внутренняя структура |
Гомогенная, зернистая, неоднородная |
|
|
Консистенция |
Вязкая, слизистая, крошковидная |
|
|
Эмульгирование в капле воды |
Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
| " |
